eISSN: 1897-4252
ISSN: 1731-5530
Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska/Polish Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Supplements Editorial board Reviewers Abstracting and indexing Contact Instructions for authors Publication charge Ethical standards and procedures
Editorial System
Submit your Manuscript
SCImago Journal & Country Rank
2/2012
vol. 9
 
Share:
Share:

Myocardial infarction in mice – tips and pitfalls on the surgical and echocardiographic techniques

Joanna Śliwka
,
Bartłomiej Kumaszka
,
Marcin Garbacz
,
Sławomir Pakuło
,
Karolina Nowak
,
Maciej Domagała
,
Tomasz Jaźwiec
,
Mateusz Zandecki
,
Tomasz Cichoń
,
Jerzy Nożyński
,
Ryszard Smolarczyk
,
Stanisław Szala
,
Marian Zembala
,
Michał Zembala

Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska 2012; 2: 243–251
Online publish date: 2012/07/02
Article file
- 18 Sliwka.pdf  [2.45 MB]
Get citation
 
 

Wstęp

Doświadczenia przedkliniczne na zwierzętach eksperymentalnych są nieodzownym elementem badania skuteczności i bezpieczeństwa zarówno nowych technologii medycznych i farmakologicznych, jak i procedur leczniczych. Na przestrzeni lat opracowano wiele modeli zwierzęcych imitujących patologię człowieka po to, by móc sprawnie i wiarygodnie ocenić efekt nowo wprowadzanej terapii. W chorobach serca i naczyń wykorzystywane są zarówno duże zwierzęta doświadczalne (świnia, owca), szczególnie przydatne w modelach stworzonych na potrzeby testowania nowych technologii medycznych (urządzenia wspomagające pracę lewej komory, zastawki serca), jak i małe zwierzęta doświadczalne (szczury, myszy). Małe zwierzęta doświadczalne oferują niezwykle szerokie możliwości badawcze, począwszy od doświadczeń z farmakoterapii poprzez modele cukrzycy, hipercholesterolemii aż od genetycznie modyfikowanych zwierząt pozwalających na zaawansowane transgeniczne przeszczepy tkanek i narządów. Ponadto oczywistą zaletą pozostanie nieskomplikowana i relatywnie niskokosztowa hodowla, a także krótki okres rozrodczy (10 tygodni) oraz tylko 19-dniowy czas rozrodu.

Na potrzeby doświadczeń związanych z naprawą i odbudową niedokrwionego mięśnia sercowego materiałem biologicznym pochodzącym od człowieka, konieczne jest zastosowanie skutecznego i powtarzalnego modelu zawału serca u zwierzęcia genetycznie zmodyfikowanego. Model mysi, którego istotą jest selektywne, chirurgiczne zamknięcie gałęzi zstępującej lewej tętnicy wieńcowej, jest modelem uznanym, o potwierdzanej wielokrotnie efektywności [2–15]. Jednakże w dostępnym piśmiennictwie metoda ta nie jest opisywana na tyle dokładnie, aby podczas pierwszych doświadczeń uzyskać zamierzony efekt. Techniczne aspekty są często pomijane lub opisane bardzo enigmatycznie, uniemożliwiając osiągnięcie powtarzalnego wyniku. Dlatego też celem niniejszego opracowania jest opisanie technicznych zagadnień przeprowadzenia zabiegu podwiązania LAD u myszy wraz ze wskazaniem błędów, powikłań oraz trudności chirurgicznych. Uwagi o szczególnym znaczeniu oznaczono graficznie (UWAGA à), wskazując jednocześnie sposób rozwiązania problemu.

Materiał i metody

Doświadczenie przeprowadzono zgodnie z Ustawą o doświadczeniach na zwierzętach z dnia 21 stycznia 2005 r.

i za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. W doświadczeniach wykorzystano samce myszy szczepu C57BL/6 (masa ciała średnio 21,5 g). Wstępnie zwierzęta znieczulano wziewnie przy użyciu izofluranu w stężeniu 3,5% w komorze do znieczuleń (VevoAnesthesia System – VAS). Komora VAS jest prostym urządzeniem, zbudowanym z przezroczystego materiału z podajnikiem gazu anestezjologicznego. VevoAnesthesia System jako element systemu Vevo jest wygodnym w zastosowaniu udogodnieniem umożliwiającym bezstresowe dla zwierzęcia, szybkie wprowadzenie w stan znieczulenia. Jednakże w przypadku ograniczonego budżetu możliwe jest wykonanie podobnego urządzenia samodzielnie.



Intubacja



Intubacja myszy nie nastręcza trudności, gdy opanowane zostaną jej podstawy. Konieczna jest mała, zakrzywiona pęseta (jako laryngoskop) oraz wenflon o rozmiarze 20G, najlepiej przycięty do długości ok. 2,5 cm (rurka intubacyjna). Dobrze mieć także stępioną igłę do tegoż wenflonu (20G), która służyć będzie jako prowadnica rurki intubacyjnej. Rurkę intubacyjną nakładano na prowadnicę tak, aby końcówka igły nieznacznie wystawała.

Znieczuloną mysz układano na grzbiecie, opierając jej potylicę na zwiniętym gaziku celem odgięcia głowy. Rozwierano jamę gębową palcami i utrzymywano ją w tej pozycji, zakładając za górne siekacze umocowaną do stołu operacyjnego gumkę. Skierowywano światło lampy na szyję myszy. Uwidocznienie wejścia do krtani uzyskiwano poprzez odsunięcie języka na bok pęsetą anatomiczną trzymaną w jednej dłoni. Jednocześnie stosowano lekki ucisk szyi palcem tej samej dłoni. W momencie rozwarcia szpary głośni wprowadzano do tchawicy trzymaną w drugiej dłoni prowadnicę z rurką intubacyjną. Koniec rurki powinien się znajdować ok. 0,5 cm poniżej wejścia do krtani.

Kolejnym krokiem było podłączenie do rurki intubacyjnej zestawu do wentylacji i sprawdzenie, poprzez obserwację ruchów klatki piersiowej, czy jej położenie jest prawidłowe. UWAGA à Ze względu na krótki czas działania izofluranu istotne jest wcześniejsze skompletowanie zestawu intubacyjnego i odpowiednie jego ułożenie – laryngoskop po jednej, a prowadnica z rurką intubacyjną po drugiej stronie stolika operacyjnego. Takie ustawienie narzędzi pozwala operatorowi na swobodne ich pobieranie i odkładanie bez konieczności odrywania wzroku od myszy. UWAGA à Zaraz po weryfikacji położenia rurki intubacyjnej trzeba ją zabezpieczyć, przyklejając do stołu operacyjnego, by nie uległa przypadkowemu przesunięciu podczas zabiegu chirurgicznego.



Wentylacja



Sztuczną wentylację prowadzono przy użyciu systemu MiniVent Model 845 (Harvard Apparatus, USA), z standardowymi parametrami częstości oddechów 120/min i objętości oddechowej 200–250 μl, z zastosowaniem wziewnego znieczulenia izofluranem w stężeniu 1,5%. Aparat MiniVent pozwala na prowadzenie mechanicznej wentylacji małych zwierząt (mysz, szczur) z objętością wdechową 30–350 µl z częstością 60–400 oddechów/min.

Tak przygotowane zwierzę spoczywa na stoliku operacyjnym, najlepiej podgrzewanym, by utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 ±1°C. Stoły operacyjne dla małych zwierząt doświadczalnych znajdują się w ofercie wielu znanych producentów (Harvard Apparatus, Holliston, USA). Jednakże ze względów ekonomicznych postanowiliśmy zlecić wykonanie takiego urządzenia firmie polskiej na podstawie opracowanych przez nasz zespół specyfikacji. Tak powstały produkt w zupełności spełnia oczekiwania, ponieważ umożliwia przeprowadzanie operacji na małych zwierzętach (mysz, szczur) z możliwością regulacji temperatury w zakresie 20–80°C oraz regulacji pochylenia platformy roboczej we wszystkich kierunkach.



Zabieg chirurgiczny



Po wcześniejszym wygoleniu lewej strony klatki piersiowej w odległości ok. 2 mm od mostka wykonywano skośne cięcie o dł. 8 mm w kierunku lewego barku na wysokości

3. lub 4. przestrzeni międzyżebrowej (ryc. 1.) Po uwidocznieniu dużego, powierzchownego naczynia żylnego przebiegającego równolegle do mostka, ok. 3 mm od jego lewej krawędzi, a także powięzi (przezroczystej, cienkiej błonki) wraz z mięśniem piersiowym większym, preparowano okolicę, oddzielając tenże mięsień w kierunku bocznym, nie nacinając go, co pozwalało na mało traumatyczne dotarcie do głębszej warstwy mięśni klatki piersiowej. Kolejno, delikatnymi ruchami pęsetą anatomiczną, nad górnym brzegiem 3. lub 4. żebra docierano do opłucnej ściennej, którą nożyczkami chirurgicznymi przecinano, wchodząc bezpośrednio do lewej jamy opłucnej. Opłucną nacinano na odcinku ok. 5 mm, kierując się przyśrodkowo do lewego brzegu mostka (uwaga na tętnicę piersiową wewnętrzną lewą). Do odsuwania żeber i dobrego wglądu w jamę klatki piersiowej używano rozwieracza do naczyń wieńcowych stosowanego u ludzi (Coronary Artery Retraction Clip, Surge Cardiovascular, USA). Po odnalezieniu i odsunięciu do dołu lewego płuca, lekko z zewnątrz uciskając klatkę piersiową, uwidaczniano przednio-boczną ścianę lewej komory otoczoną cienkim, przezroczystym workiem osierdziowym. W celu dokładnej lokalizacji gałęzi zstępującej przedniej (ang. left anterior descending – LAD) istotne było odnalezienie uszka lewego przedsionka, spod którego wyraźnie widoczny był proksymalny odcinek LAD. Gałąź zstępującą przednią uwidaczniano na przedniej powierzchni serca jako pulsującą jasną smugę, biegnącą pośrodkowo w kierunku koniuszka serca. W kolejnym etapie, po względnym ustabilizowaniu serca pomiędzy palcami operatora, podkłuwano i podwiązywano LAD 1–2 mm poniżej uszka lewego przedsionka przy użyciu nici polipropylenowej (Prolene 8-0, Ethicon). Potwierdzeniem całkowitego zamknięcia naczynia była natychmiastowa zmiana koloru (zblednięcie) obszaru lewej komory zaopatrywanego przez LAD (ryc. 2.). Jamę klatki piersiowej dokładnie osuszano z krwi gazikami, odmę niwelowano, uciskając klatkę piersiową i niejako ,,wyciskając’’ powietrze w niej zawarte. Zaniechanie tych czynności skutkowało pojawianiem się dużych artefaktów w późniejszym kontrolnym badaniu echokardiograficznym. Ścianę klatki piersiowej zamykano poprzez zbliżenie 3. i 4. że-

bra dwoma szwami (Prolene 5-0, Ethicon). Warstwę mięś-

ni zamykano standardowo przy użyciu polipropylenowego szwu (Prolene 8-0, Ethicon). Miejscowo znieczulano mięś-

nie i tkankę podskórną 1-procentowym roztworem lignokainy (ok. 1–2 krople). Skórę zszywano pojedynczymi, 5 lub 6 szwami tego samego rozmiaru. Zwierzę wybudzano i po uzyskaniu pewności powrotu własnego oddechu ekstubowano. Średni czas trwania zabiegu wynosił 20 min.



Okres pooperacyjny



W okresie pooperacyjnym umieszczano zwierzę w osobnej klatce z pełnym dostępem do pokarmu i wody do czasu powrotu pełnej ruchomości zwierzęcia.



Ocena ultrasonokardiograficzna



Zwierzęta poddawano 21-dniowej obserwacji, w czasie której wykonywano przezklatkowe badanie echokardiograficzne wg schematu: 7, 14 i 21 dniu po zabiegu.

Niestety, wykonanie badania echokardiograficznego u przytomnego zwierzęcia jest niemożliwe, dlatego też przed jego wykonaniem zwierzęta znieczulano izofluranem o stężeniu 3% w komorze do znieczuleń (VevoAnesthesia System), a następnie umieszczano na platformie VAS z możliwością odczytu EKG i kontynuowano wziewne znieczulenie izofluranem w stężeniu 1,5% (ryc. 3.). Platforma VAS jest integralnym elementem systemu VAS i pozwala na bezpieczne wykonanie badania echokardiograficznego u małych zwierząt doświadczalnych (należy uważać przy zakupie – są dwie wersje w zależności od gatunku zwierząt). Platforma jest podgrzewana i wyposażona w elektrody do odczytu EKG. Jest ona również zespolona z ramieniem podtrzymującym głowicę echokardiograficzną, co umożliwia odpowiednie ustawienie zwierzęcia, wykonanie precyzyjnych pomiarów podczas badania ultrasonograficznego oraz eliminuje efekt drżenia ręki badacza. Podczas badania monitorowana jest również temperatura zwierzęcia przy użyciu sondy doodbytniczej.

Badanie echokardiograficzne wykonywano za pomocą aparatu Vevo® 2100 Imaging System (VisualSonics, Toronto, Kanada) wyposażonego w głowicę MS400 o rozdzielczości 30 MHz. Klatkę piersiową oczyszczano z sierści, aby zminimalizować zakłócenia sygnału. Po 15-minutowym okresie adaptacji układu krążenia wykonywano badanie echokardiograficzne. Z uwagi na charakter doświadczenia wykonywano konwencjonalne (B-mode oraz M-mode) pomiary funkcji i wymiarów lewej komory serca (ang. left ventricle – LV) w projekcji przymostkowej w osi długiej (ang. parasternal long axis view – PLAX) i oznaczono wymiar wewnętrzny lewej komory w skurczu (ang. left ventricle internal diameter in systole – LVIDs) oraz w rozkurczu (ang. left ventricle internal diameter in diastole – LVIDd). W osi krótkiej (ang. parasternal short axis view – PSAX) oznaczono LVIDd, LVIDs oraz dodatkowo grubość ściany przedniej LV w skurczu (ang. left ventricle anterior wall in systole – LVAWs) oraz w rozkurczu (ang. left ventricle anterior wall in diastole – LVAWd). Za pomocą specjalistycznego oprogramowania VevoStrain oceniano również prędkość (ang. velocity), odkształcenie (ang. strain), przemieszczenie (ang. displacement) oraz tempo odkształcenia (ang. strainrate) w trzech kierunkach deformacji mięśnia sercowego: w przekroju podłużnym wzdłuż osi długiej (ang. longitudinal) oraz wzdłuż promienia (ang. radial) (ryc. 4A), a w przekroju poprzecznym wzdłuż promienia (ang. radial) oraz wzdłuż obwodu (ang. circumferential) (ryc. 4B). Dla każdej wielkości zapisywano wynik w postaci obrazu, pliku wideo oraz wykresu (ryc. 5).

Wykorzystując funkcję oprogramowania time to peak (z ang. czas potrzebny do uzyskania maksymalnej wartości), oceniano synchroniczną zmianę długości, średnicy oraz grubości ściany miokardium w 6 różnych segmentach w przekroju poprzecznym (1 – ściana przednia, 2 – ściana boczna, 3 – ściana tylna, 4 – ściana dolna, 5 – tylna część przegrody międzykomorowej, 6 – przednia część przegrody międzykomorowej) i podłużnym lewej komory (ściana tylna: 1 – część przypodstawna, 2 – część środkowa, 3 – część koniuszkowa; ściana przednia: 4 – część przypodstawna, 5 – część środkowa, 6 – część koniuszkowa) (ryc. 6A–B). Dla każdego segmentu oceniano 4 parametry: prędkość (ang. velocity), przemieszczenie (ang. displacement), odkształcenie (ang. strain) oraz tempo odkształcenia (ang. strainrate) i zapisywano w formie tabeli, diagramu i wykresu (ryc. 7).



Ocena histopatologiczna



W 28. dobie zwierzęta poddawano eutanazji i eksplantowano serca. Przed pobraniem serca wstępnie perfundowano 1-procentowym roztworem formaliny poprzez wsteczne bezpośrednie podanie do aorty piersiowej przy użyciu dożylnego cewnika o rozmiarze 24G. Wykonane preparaty wybarwiano standardowo hematoksyliną i eozyną (H+E) oraz wykonywano barwienie trójbarwne zrębu łącznotkankowego wg Massona.

Wyniki

Wykonano łącznie 77 zabiegów podwiązania LAD u myszy. Początkowo wysoką śmiertelność (90%) w ciągu pierwszych 3 miesięcy wiązano z brakiem doświadczenia w wykonywaniu intubacji oraz procedur mikrochirurgicznych. W kolejnych miesiącach śmiertelność spadła do 40%.



Ocena ultrasonokardiograficzna



W badaniu UKG potwierdzono upośledzenie kurczliwości mięśnia lewej komory w regionie dystrybucji gałęzi zstępującej przedniej zarówno w przekroju podłużnym, jak i poprzecznym. Obserwowano obniżanie frakcji wyrzutowej lewej komory (ang. left ventricular ejection fraction – LVEF) z 47% do 33% (> 10% wyjściowej wartości) i ścieńczenie przedniej ściany oraz okolicy koniuszka lewej komory. W projekcji B-mode w przekroju podłużnym obserwowano poszerzanie jamy LV i powstawanie tętniaka okolicy koniuszka LV zależne od czasu obserwacji (ryc. 8.) oraz obniżanie grubości wolnej ściany LV z towarzyszącym kompensacyjnym przerostem miokardium nieobjętego zawałem w przekroju poprzecznym LV. W analizie odkształceń wykazano zmiany stopnia odkształcenia, tempa odkształcenia, prędkości i przemieszczenia segmentów przykoniuszkowych w osi podłużnej LV, co świadczy o asynchronii skurczu segmentów komory objętych niedokrwieniem. Analiza time to peak również potwierdziła zmiany zachodzące w segmentach przykoniuszkowych i wolnej ściany lewej komory.



Ocena histopatologiczna



Przebadano histopatologicznie 25 serc mysich. Po 28 dniach od chirurgicznej okluzji tętnicy wieńcowej uwidoczniono cechy przebytego zawału, zapalenia mięśnia sercowego oraz wczesnej kardiomiopatii niedokrwiennej. W interpretacji brano pod uwagę obecność blizny łączno-

tkankowej (ryc. 9. i 10.), waskularyzacji, nacieków zapalnych (ryc. 11.) oraz przerostu kardiomiocytów. W 14 przypadkach potwierdzono przebyty zawał, w 6 nie znaleziono cech zawału. W 5 przypadkach włóknienie powierzchowne i naciek zapalny nasierdzia mogą świadczyć o podwiązaniu jednej z mniejszych gałęzi tętnicy przedniej zstępującej. Skuteczność wywołania zawału potwierdzona w badaniu histopatologicznym wynosiła 56%.

Dyskusja

Koncepcja modelu pozawałowej niewydolności serca u myszy powstała już w latach 70. ubiegłego wieku [18] i była doskonalona indywidualnie przez różnych badaczy przez lata. Obecnie brakuje kursów doskonalących dla chirurgów wykonujących doświadczenia na zwierzętach, a w obszernym piśmiennictwie [2, 3, 5, 6, 9–12, 14–16, 18] nie podano opisu każdego kolejnego etapu wykonywania procedury zamknięcia LAD na tyle dokładnego, aby pierwsze próby wykonania eksperymentu zakończyły się sukcesem.

Ze względu na małe rozmiary, łatwość hodowli, krótki okres rozrodczy i krótki okres ciąży w doświadczeniach długoterminowych najczęściej wykorzystywane są szczury i myszy. Istotną przewagą myszy nad szczurami jest większa możliwość pozyskiwania szczepów transgenicznych [16]. Obecnie dostępnych jest wiele szczepów tych laboratoryjnych zwierząt, a chów wsobny pozwala uniknąć różnic wynikających z naturalnej zmienności pomiędzy osobnikami, co zapewnia powtarzalność i wiarygodność wyników. Szczep C57BL/6 jest najbardziej rozpowszechnionym szczepem wsobnym. Myszy tego szczepu wykorzystywane są do celów doświadczalnych w pracach badawczych dotyczących rozwoju, zmian sercowo-naczyniowych, cukrzycy, otyłości, genetyki, immunologii, neurobiologii oraz zaburzeń czuciowo-nerwowych, ponieważ mają podobny do ludzkiego układ rozrodczy, nerwowy, sercowo-naczyniowy i cierpią z powodu takich samych chorób, np. nowotworów czy cukrzycy. Hodowla tego odpornego na powstawanie guzów nowotworowych szczepu nie jest wymagająca, charakteryzuje się również niskimi kosztami utrzymania w porównaniu z innymi gatunkami. Ponadto opisywana długość życia tych zwierząt przekracza przeciętną dla obu płci (> 600 dni w standardowych warunkach). Jest to szczep wykorzystywany także jako baza do pozyskiwania innych szczepów zarówno z wyindukowanymi, jak i spontanicznymi mutacjami [17]. Mysz stanowi dobry model procesów chorobowych ludzi również ze względu na bardzo podobną budowę DNA i podobną ekspresję genów, gdyż 98% genów obecnych u ludzi ma swoje odpowiedniki u myszy.

Już na etapie przygotowania zwierzęcia do zabiegu chirurgicznego należy zwrócić uwagę na kilka elementów. Jednym z bardziej istotnych jest utrzymanie stałej temperatury ciała na poziomie 36 ±1°C, gdyż myszy źle tolerują temperatury < 35°C (bradykardia), zwłaszcza że podczas procedury pozbawiamy zwierzęta ich naturalnego izolatora na ok. 20% powierzchni ciała.

Kolejnym etapem jest znieczulenie. Należy rozróżnić znieczulenie dootrzewnowe i wziewne. Tutaj rodzaj i dawki leków powinny być optymalizowane dla danego laboratorium badawczego, ponieważ w dostępnym piśmiennictwie nie ma ustalonej jednej, powtarzalnej dawki dla ketaminy, ksylazyny i pentobarbitalu (najczęściej używanych leków podawanych dootrzewnowo), a rozpiętość dawki leku w mg na kg m.c. jest na tyle duża (dla ketaminy 50–150 mg/kg m.c., dla ksylazyny 5–20 mg/kg m.c. [19], a dla pentobarbitalu 33–100 mg/kg m.c. [2, 5, 6, 20, 21]), że na etapie wyboru, przed jakim staje badacz, decyzja może być trudna. W przypadku znieczulenia wziewnego dawka izofluranu została ustalona na 3,5–4% w komorze do znieczuleń oraz 1–2% po intubacji dotchawiczej [3, 7, 9, 16, 22]. Rozpiętość dawek leków wynika nie tylko z rodzaju procedury diagnostycznej lub chirurgicznej i przewidywanego czasu jej trwania

(np. krótkie ok. 10-minutowe znieczulenie do badania echokardiograficznego i dłuższe, trwajace 20–30 min, do zabiegów na otwartej klatce piersiowej), ale jest także uzależniona od różnej wrażliwości na leki poszczególnych szczepów myszy i wywołanego efektu znieczulenia bądź jedynie unieruchomienia. W naszym laboratorium w początkowym etapie podawano ketaminę i ksylazynę w dawce odpowiednio 80 mg/kg m.c. i 5 mg/kg m.c., obserwowano jednak ich silne działanie kardiodepresyjne (spadek akcji serca

z 350–400/min nawet do 150/min), dlatego w kolejnych doświadczeniach leki te podawane były dopiero po wykonaniu badania echokardiograficznego, chroniąc w ten sposób serce przed ich negatywnym działaniem. Po zaintubowaniu dodatkowo podawano wziewnie izofluran o stężeniu 1,5%, uzyskując zarówno unieruchomienie, jak i brak reakcji na bodźce bólowe. Ze względu na efekt kardiodepresyjny w kolejnych doświadczeniach zrezygnowano z podawania ketaminy z ksylazyną, pozostając podczas całej procedury tylko przy znieczuleniu wziewnym z zadawalającym efektem.

Metoda intubacji wcześniej opisywana przez Tarnav-

skiego [2] i Browna [23], mimo że zawierała dokładny opis, nie uchroniła nas od błędów. Najczęściej dochodziło do powstawania odmy opłucnowej przez zbyt głębokie położenie rurki lub intubacji przełyku. Doświadczenie wynikające z wielu prób, w połączeniu z dobrze przygotowanym zestawem narzędzi, pozwalało na sprawne i skuteczne przeprowadzanie intubacji. Sposób intubacji tchawicy pod kontrolą wzroku opisywany przez Kido [7] wymagał wykonania krótkiego nacięcia skóry szyi i uwidocznienia tchawicy, co wiązało się z przedłużeniem procedury i wprowadzeniem kolejnego miejsca potencjalnej infekcji oraz możliwości uszkodzenia struktur anatomicznych tej okolicy ciała. Metoda intubacji przy użyciu narzędzi imitujących laryngoskop (pęseta, szpatułka) wydaje się bezpieczniejsza, a przede wszystkim szybsza [23].

Otwarcie klatki piersiowej w 4. przestrzeni międzyżebrowej przeprowadzano w sposób opisywany wcześniej [2], natomiast kluczowe okazało się unikanie przecinania mięśnia piersiowego większego, dzięki któremu podczas zamykania klatki piersiowej możliwe jest utrzymanie jej stabilności i szczelności.

Model indukowanej niedokrwieniem przewlekłej niewydolności serca poprzez podwiązanie LAD jest szeroko stosowany w pracach dotyczących nie tylko poznania mechanizmów powstawania [24] i zapobiegania przebudowie mięśnia sercowego [4, 7, 25], lecz także prób jej odwrócenia [22]. Inne metody, wykorzystujące niskie temperatury [9] do wywoływania krótkotrwałego niedokrwienia mięśnia sercowego, stosuje się raczej do badania nie tyle przewlekłej przebudowy mięśnia, ile jego reakcji na czasowe niedokrwienie i tzw. proces uszkodzenia poreperfuzyjnego [2, 5, 9]. Podwiązanie LAD powoduje trwałe, postępujące i nieodwracalne zmiany funkcjonalne (obniżenie frakcji wyrzutowej, powiększenie jamy LV) oraz strukturalne (ścieńczenie ściany LV, powstawanie łącznotkankowej blizny) będące następstwem remodelingu. Należy pamiętać, że naczynia wieńcowe u myszy położone są głębiej w mięśniówce LV, z tego powodu wyznacza się na sercu tzw. markery, czyli punkty będące wskaźnikiem położenia LAD. W modelu mysim markerem położenia LAD jest uszko lewego przedsionka. Ze względu na brak standaryzacji nazw gałęzi tętnicy wieńcowej lewej Ahn i wsp. [10] ujednolicili nazewnictwo i ustalili 3 typy zmienności anatomicznej: I typ – trzy niezależne (L1, L2, L3) gałęzie lewokomorowe (41,5%) , II typ – pierwsze dwie (L1–L2, L3) gałęzie odchodzące wspólnym pniem (35,8%) oraz III typ – druga i trzecia (L1, L2–L3) gałąź odchodzą wspólnym pniem (15,1%) oraz odległości L1 ok. 2 mm od ujścia LTW (ryc. 12A–C.).

W przypadku 47,2% myszy obserwowano również obecność gałęzi prawokomorowej odchodzącej od LTW. Poznanie zmienności anatomicznej lewej tętnicy wieńcowej pozwoliło ustalić optymalne miejsce podkłucia LAD, które z jednej strony spowoduje ostre, ograniczone niedokrwienie mięśnia sercowego, a z drugiej nie przyczyni się do wstrząsu kardiogennego i natychmiastowej śmierci zwierzęcia. Ustalono, że podwiązanie LAD w odległości ok. 2 mm od uszka lewego przedsionka powinno wywołać zawał obejmujący 40–50% mięśniówki lewej komory [2]. Niepowodzenie procedury

i/lub wysoką śmiertelność okołooperacyjną można wiązać zarówno ze zbyt wysokim podwiązaniem LAD i wywołaniem zawału obejmującego ponad 50% masy lewej komory, jak i zbyt dystalnym podwiązaniem skutkującym z kolei powstaniem zawału o małej powierzchni (< 30% powierzchni LV) bądź podwiązaniem tylko drobnych odgałęzień LAD w miejscu mylnie utożsamianym z przebiegiem LTW. Odsetek wywołanych zawałów w naszym materiale na poziomie 56% wynikał najpewniej z krzywej uczenia, czego potwierdzeniem jest większa skuteczność wywołania zawału i przeżywalność zwierząt w ostatnich 2 miesiącach wykonywania procedur. Najczęstszym obserwowanym powikłaniem okołooperacyjnym pozostawały zaburzenia rytmu i kurczliwości. Dwie myszy, które po zabiegu podwiązania LAD wybudzono i umieszczono w klatkach, znaleziono martwe w 2. dobie po zabiegu, najprawdopodobniej doznały rozległego zawału. Oceniono, że już po 24 godzinach od podwiązania LAD w mięśniówce LV dochodzi do widocznych w badaniu histopatologicznym zmian morfologicznych (ścieńczenia wolnej ściany lewej komory), po tygodniu można zaś wykazać obecność pełnościennej blizny z obecnością włókien kolagenowych [11]. Powodzenie eksperymentu uzależnione jest nie tylko od znajomości anatomii i teoretycznego przygotowania, ale także od cierpliwości i doświadczenia operatora, ponieważ ze względu na rozmiary zwierzęcia zabieg chirurgiczny musi być przeprowadzany w krótkim czasie, delikatnie, ale precyzyjnie, bez zbędnych, nerwowych ruchów.

Istotnym postępowaniem w trakcie zamykania klatki piersiowej okazało się staranne oczyszczanie jamy opłucnej z nagromadzonej krwi i powietrza, które mogą stać się przyczyną powstawania artefaktów podczas pooperacyjnego badania echokardiograficznego.

Po zamknięciu klatki piersiowej ważna pozostaje ciągła obserwacja zwierzęcia aż do powrotu własnego oddechu i często spontanicznej ekstubacji. Ze względu na występowanie wśród gryzoni zjawiska kanibalizmu należy pamiętać o umieszczeniu myszy w osobnej klatce do czasu powrotu pełnej świadomości.

W okresie przed- i pooperacyjnym, nieinwazyjnym i łatwo dostępnym badaniem monitorującym zmiany zachodzące w uszkodzonym mięśniu sercowym pozostaje echokardiografia przezklatkowa. Mimo że jest to ogólnie dostępna metoda oceniająca funkcję mięśnia sercowego, konwencjonalne pomiary nie wykrywają wczesnych zmian funkcjonalnych lewej komory. Istotna zmiana struktury i funkcji lewej komory oceniana na podstawie UKG jest manifestacją późnych zmian chorobowych. Pomiary LVEF w modelu niewydolności serca często bywają w granicach normy. Dostępne konwencjonalne techniki (echokardiografia dwu- i trójwymiarowa, dopplerowska i tkankowa) pozwalają ocenić funkcję i morfologię uszkodzonego niedokrwieniem serca. Natomiast wprowadzona nowatorska technika obrazowania (ang. strain analysis), u podstawy której leży analiza odkształceń, znacząco poprawiła ocenę funkcji LV, ponieważ umożliwia wykrycie zmian wcześniej niż analiza konwencjonalna [1, 26]. Oprogramowanie VevoStrain Software pozwala monitorować dyskretne zmiany funkcji serca i postęp remodelingu w modelu niedokrwiennej niewydolności serca, umożliwiając ocenę zarówno globalnego, jak i regionalnego ruchu wykonywanego przez ścianę LV. Ocena odkształcenia może dotyczyć wyznaczonego, pojedynczego punktu wsierdzia lub nasierdzia, pojedynczego segmentu bądź lewej komory jako całości.

Należy pamiętać, że istnieje wiele czynników, które mogą istotnie wpływać na jakość badania echokardiograficznego. Pierwszy i zarazem najistotniejszy czynnik to sprzęt, który powinien być przystosowany do pracy z małymi zwierzętami laboratoryjnymi. Serce myszy wielkości ziarenka kawy waży ok. 2–3 g, bije z częstością 480–720 uderzeń/min i choć te wartości różne są dla płci, wielkości czy nawet szczepu, wskazują, że rozdzielczość aparatu musi być na tyle wysoka, aby umożliwić dokładne zbadanie zmian morfologicznych i czynności serca tych małych zwierząt. Zgodnie z zasadą większa częstotliwość to także większa rozdzielczość, do badania serc mysich zastosowano głowicę MS400 o rozdzielczości 30 MHz, która jest integralną częścią aparatu Vevo® 2100 Imaging System (VisualSonics, Toronto, Kanada) (dla porównania u ludzi wykorzystuje się głowice o częstotliwościach 5–15 MHz).

Podobnie jak w przypadku wykonywania procedur chirurgicznych ocena echokardiograficzna wymaga od badacza doświadczenia. Syed i wsp. [27] podają, że wykonanie co najmniej 75–100 badań pozwala uzyskać obrazy powtarzalne pod względem jakościowym. Pomocne wydaje się szkolenie nie tylko w pracowni echokardiograficznej, lecz także udział w szkoleniach praktycznych i teoretycznych organizowanych przez producenta sprzętu.

Metodą obrazowania, która jakością, obiektywnością, dokładnością oceny budowy i funkcji serca oraz powtarzalnością przewyższa badanie echokardiograficzne, pozostającą nadal „złotym standardem”, jest rezonans magnetyczny (ang. nuclear magnetic resonance – NMR) [1]. Wykonanie tego badania nie jest obarczone wysokim ryzykiem powikłań, choć wymaga dostępu do żyły, znieczulenia zwierzęcia i jest czasochłonne (15–30 min). [15] Wysoki koszt, konieczność posiadania wielkogabarytowej aparatury oraz złożoność procedury powodują, że badanie to jest trudno dostępne dla większości badaczy.

Wnioski

Zaprezentowany model zawału mięśnia sercowego pozwala uzyskać pewny, ograniczony obszar martwicy przy stosunkowo niskim ryzyku niepowodzenia. Sukces eksperymentu w dużym stopniu uzależniony jest od doświadczenia operatora i rzetelnego teoretycznego przygotowania nie tylko chirurgicznego, lecz także w dziedzinie opieki anestezjologicznej śród- i pooperacyjnej.

Wdrożenie metody oraz wprowadzenie nowoczesnych metod monitorowania zmian zachodzących w niedokrwionym mięśniu umożliwi opracowanie skutecznej i bezpiecznej metody naprawy niewydolnego, uszkodzonego niedokrwieniem serca z wykorzystaniem nowych, optymalnych i zindywidualizowanych rozwiązań terapeutycznych mających wpływ na zmniejszenie się wskaźnika śmiertelności z powodu chorób serca i układu krążenia.



Źródło finansowania

Badanie powstało w ramach projektu pt. „SERCOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE I PROGENITOROWE – nowa metoda regeneracji uszkodzonego serca”, realizowanego przez Śląskie Centrum Chorób Serca we współpracy z Centrum Onkologii – Instytutem im. Marii Skłodowskiej-Curie, oddział w Gliwicach oraz Fundacją Rozwoju Kardiochirurgii z Zabrza.



Projekt „SERCOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE I PROGENITOROWE – nowa metoda regeneracji uszkodzonego serca” jest współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, 2007–2013.

Piśmiennictwo

1. Szymczak E, Lipiec P, Kurpisz M, Krzemińska-Pakuła M, Kasprzak JD. Zaawan-

sowane metody echograficznej oceny funkcji mięśnia sercowego u myszy

z indukowanym zawałem mięśnia sercowego. Pol Prz Kardiol 2009; 11: 189-194.

2. Tarnavski O, McMullen JR, Schinke M, Nie Q, Kong S, Izumo S Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Geno-

mics 2004; 16: 349-360.

3. Takagawa J, Zhang Y, Wong ML, Sievers RE, Kapasi NK, Wang Y, Yeghiazarians Y, Lee RJ, Grossman W, Springer ML Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol 2007; 102: 2104-2111.

4. Roubille F, Combes S, Leal-Sanchez J, Barrère C, Cransac F, Sportouch-Dukhan C, Gahide G, Serre I, Kupfer E, Richard S, Hueber AO, Nargeot J, Piot C,

Barrère-Lemaire S. Myocardial expression of a dominant-negative form of Daxx decreases infarct size and attenuates apoptosis in an in vivo mouse model of ischemia/reperfusion injury. Circulation 2007; 116: 2709-2717.

5. Redel A, Jazbutyte V, Smul TM, Lange M, Eckle T, Eltzschig H, Roewer N, Kehl F.

Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Exp Biol Med 2008; 233: 84-93.

6. Lutgens E, Daemen MJ, de Muinck ED, Debets J, Leenders P, Smits JF. Chro-

nic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res 1999; 41: 586-593.

7. Kido M, Du L, Sullivan CC, Li X, Deutsch R, Jamieson SW, Thistlethwai-

te PA. Hypoxia-inducible factor 1-alpha reduces infarction and attenuates progression of cardiac dysfunction after myocardial infarction in the mouse.

J Am Coll Cardiol 2005; 46: 2116-2124.

8. Hoit BD, Ball N, Walsh RA. Invasive hemodynamics and force-frequency relationships in open- versus closed-chest mice. Am J Physiol 1997; 273 (5 Pt 2):

H2528-2533.

9. van den Bos EJ, Mees BM, de Waard MC, de Crom R, Duncker DJ. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 289: H1291-1300.

10. Ahn D, Cheng L, Moon C, Spurgeon H, Lakatta EG, Talan MI. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 286: H1201-1207.

11. http://cardiogenomics.med.harvard.edu/projects/p1/education/MI/cvgen_anim.html.

12. Du XJ, Gao XM, Ramsey D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart J 1998; 7: 187-192.

13. Gao XM, Dart AM, Dewar E, Jennings G, Du XJ. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovasc Res 2000; 45: 330-338.

14. Patten RD, Aronovitz MJ, Deras-Mejia L, Pandian NG, Hanak GG, Smith JJ, Mendelsohn ME, Konstam MA. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. Am J Physiol 1998; 274 (5 Pt 2): H1812-820.

15. Yang Z, Berr SS, Gilson WD, Toufektsian MC, French BA. Simultaneous evaluation of infarct size and cardiac function in intact mice by contrast-enhanced cardiac magnetic resonance imaging reveals contractile dysfunction in noninfarcted regions early after myocardial infarction. Circulation 2004; 109: 1161-1167.

16. Springer ML, Sievers RE, Viswanathan MN, Yee MS, Foster E, Grossman W,

Yeghiazarians Y. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 289: H1307-1314.

17. http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html.

18. Zolotareva AG, Kogan ME. Production of experimental occlusive myocardial infarction in mice. Cor Vasa 1978; 20: 308-314.

19. http://www.aalas.org/.

20. http://www.iacuc.ucsf.edu/Proc/awMouseFrm.asp.

21. Buitrago S, Martin TE, Tetens-Woodring J, Belicha-Villanueva A, Wilding GE. Safety and efficacy of various combinations of injectable anesthetics in BALB/c mice. J Am Assoc Lab Anim Sci 2008; 47: 11-17.

22. Lutz M, Rosenberg M, Kiessling F, Eckstein V, Heger T, Krebs J, Ho AD, Kat-

us HA, Frey N Local injection of stem cell factor (SCF) improves myocardial homing of systemically delivered c-kit + bone marrow-derived stem cells. Cardiovasc Res 2008; 77: 143-150.

23. Brown RH, Walters DM, Greenberg RS, Mitzner W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol 1999; 87: 2362-2365.

24. Bialik S, Geenen DL, Sasson IE, Cheng R, Horner JW, Evans SM, Lord EM, Koch CJ, Kitsis RN. Myocyte apoptosis during acute myocardial infarction in the mouse localizes to hypoxic regions but occurs independently of p53. J Clin Invest 1997; 100: 1363-1372.

25. Li Q, Li B, Wang X, Leri A, Jana KP, Liu Y, Kajstura J, Baserga R, Anversa P. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest 1997; 100: 1991-1999.

26. Bauer M, Cheng S, Jain M, Ngoy S, Theodoropoulos C, Trujillo A, Lin FC, Liao R. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res 2011; 108: 908-916.

27. Syed F, Diwan A, Hahn HS. Murine echocardiography: a practical approach for phenotyping genetically manipulated and surgically modeled mice.

J Am Soc Echocardiogr 2005; 18: 982-990.
Copyright: © 2012 Polish Society of Cardiothoracic Surgeons (Polskie Towarzystwo KardioTorakochirurgów) and the editors of the Polish Journal of Cardio-Thoracic Surgery (Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska). This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.